冷冻电子断层成像通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构，适合于研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器等，可获得大分子及其复合物在细胞或组织中原位的高分辨图像和结构。
快速冷冻
对于一些电子束能穿透的较小或较薄的样品， 如病毒、细菌，以及一些小细胞等，可以采用与单颗粒分析制样方法相同的快速冷冻（plunge-freezing）的方法准备样品。
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对于一些体积较大的样品，比如细胞和组织样本等则可以采用高压冷冻（high pressure freezing）的方法，常压下对生物样品进行快速冷冻，玻璃化深度只有10μm，应用高压冷冻技术制备的样品玻璃化深度可以达到200μm。
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冷冻光电关联
在复杂的细胞自然环境中，定位感兴趣的结构是非常困难的。这种情况下，可以使用冷冻关联显微镜，来确定感兴趣的目标结构，引导在电子显微镜中快速而准确地确定感兴趣的区域。在冷冻荧光显微镜成像期间，专门设计的冷冻样品载物台使样品始终保持玻璃化状态。玻璃化样品找到目标区域以后，连同其坐标被转移到冷冻聚焦离子束电子显微镜的系统中，以保护样品免于污染。
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冷冻聚焦离子束减薄
样品减薄对于电子断层成像扫描工作流程至关重要，因为只有样品足够的薄时， TEM透射电镜中200-300 keV 电子束才能够穿透样品。Aquilos Cryo-FIB 结合了扫描电子束显微镜（SEM）和聚焦离子束显微镜（FIB）两种功能。电子束用于样品成像，离子束用于从玻璃化细胞中精确移除材料。通过关联显微镜定位之后，聚焦离子束用于去除目标区域上方和下方的材料，制备足够电子穿透的lamella薄片。冷冻薄片包含感兴趣的区域，可以被减薄至200 nm。
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数据收集
经离子束减薄之后的样品冷冻薄片被转移至冷冻透射电镜（200kV或者300kV电镜）进行冷冻电子断层扫描成像。这个过程通过将样品在载物台上进行连续不断的倾转来完成。
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可视化和结构分析
将单个投影图像通过一种称为反向投影的过程进行计算组合，从而生成三维断层扫描图像。。从断层扫描图像中，可以计算提取出包含感兴趣结构的小数据子集，并对其进行图像处理。图像处理使研究人员能够在保持最可能结构的同时实现纳米级的分辨率。
